ZNAJDŹ ARTYKUŁ

Volume: 
Issue: 
4
Date of issue: 

TILLING (ang. Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) i FOX-hunting (ang. Full-length cDNA Over-eXpressing gene hunting system) to nowe metody badawcze, które umożliwiają masową i szybką analizę funkcjonalną genów. Przyspieszenie prac w tym obszarze nauk biologicznych jest konieczne do systematyzowania danych uzyskiwanych w programach sekwencjonowania genomów, genów oraz EST (ang.Expressed Sequence Tag), a także w programach badań zmian ekspresji genów, prowadzonych przy zastosowaniu analizy mikromacierzy DNA. Klasyczne metody badań funkcjonalnych były i są prowadzone drogą „od cechy do genu” (ang. Top-down/ Forward). Najpierw, przy stosowaniu metod mapowania jakościowego lub ilościowego poszukuje się markerów genetycznych silnie sprzężonych z cechą. Kosegregujące z cechą markery nanosi się na mapy fizyczne kontigów klonów bibliotek genomowych w celu wyboru klonu zawierającego poszukiwany gen, co sprawdzane jest w teście komplementacji. Wynik pozytywny tego testu potwierdza przewidziane funkcje biologiczne badanego genu, jednakże brak oczekiwanych zmian fenotypowych w transformantach nie stanowi negacji przyjętych założeń, ze względu na często zachodzące wyciszanie genów. Innym typem rozwiązań w analizie funkcjonalnej genów jest droga „od mutacji do genu” (ang. Botom-up/Reverse), zakładająca wytwarzanie, poszukiwanie oraz analizę mutantów i to właśnie podejście jest wykorzystywane w obydwu omawianych technikach. Technika TILLING, to połączenie tradycyjnej mutagenezy chemicznej z nowoczesną i czułą, techniką identyfikacji mutantów punktowych, SNP (ang. Single Nucleotide Polymorphism), opartą na analizie PCR. Metoda ta polega na namnażaniu mieszaniny równych ilości DNA poszczególnych mutantów w reakcji PCR, a następnie na trawieniu produktów endonukleazą Cel1 rozpoznającą niesparowane zasady w podwójnej nici DNA. Ważnym i trudnym etapem wstępnym jest uzyskanie odpowiednio dużej i wystarczająco wysyconej populacji mutantów, co zależy zarówno od czynnika chemicznego, jak i od modyfikowanego genomu. Drugim krytycznym krokiem jest przygotowanie DNA matrycowego, które jest kolekcjonowane w 96-dołkowych mikropłytkach. Do pojedynczej reakcji PCR przygotowuje się mieszaniny DNA zbierając do 8 probówek DNA z poszczególnych rzędów dołków, a potem (do 12 probówek) DNA z dołków kolejnych kolumn, tak że materiał z jednej mikropłytki można przeanalizować w 20 (8 + 12), a nie 96 reakcjach. Analizę DNA wielu płytek można dodatkowo usprawniać zbierając DNA z tych samych dołków różnych płytek. W celu identyfikacji mutantów każdy z produktów reakcji PCR jest poddawany denaturacji, a następnie renaturacji, co powoduje powstawanie heterodupleksów z niesparowanymi zasadami w miejscu mutacji. Trawienie tego DNA endonukleazą Cel1 specyficzną do niedopasowanych zasad umożliwia ich identyfikację po rozdziale elektroforetycznym na żelu sekwencyjnym. W metodzie TILLING identyfikacja mutantów jest szybsza niż klasyczna metoda identyfikacji mutantów SNP, gdyż: i/ zamiast koszto- i czasochłonnego sekwencjonowania wykorzystuje się enzym restrykcyjny trawiący renaturowane produkty PCR w miejscach niedopasowanych nukleotydów i standardową elektroforezę DNA; ii/ reakcja PCR prowadzona jest na skalę masową, na matrycy DNA będącej mieszaniną kilku/kilkunastu próbek. Technika FOX-hunting, to nowa metoda nadekspresji genów roślinnych, która umożliwia szybkie wyodrębnianie i sekwencjonowanie równolegle z analizą funkcjonalną. Jest ona modyfikacją/rozwinięciem metody transformacji rzodkiewnika wektorami binarnymi wprowadzanymi do komórek roślinnych przez A. tumefaciens, przez zamaczanie młodych kwiatostanów w zawiesinie biblioteki binarnej. Wektory binarne stosowane w systemie FOX-hunting zawierają pomiędzy sekwencjami granicznymi: i/ dwa tandemowe powtórzenia wzmacniacza transkrypcji (sekwencji –490 do –90 pz poprzedzającej promotor 35S wirusa mozaiki kalafiora CaMV); ii/ promotor 35S (sekwencja –90 do –1 pz wirusa CaMV); iii/ sekwencję W – 5' liderowy, nieulegający translacji odcinek RNA wirusa mozaiki tytoniu (TMV), zwiększający efektywność translacji wprowadzanego genu; iv/ kasetę zawierającą gen, którym chcemy transformować A. thaliana w otoczeniu sekwencji starterów (GS4 i GS6) ułatwiających jego identyfikację w mutancie oraz sekwencji rozpoznawanych przez endonukleazę SfiI; v/ terminator transkrypcji genu syntazy nopaliny (nos) z plazmidu Ti oraz vi/ gen selekcyjny odporności na higromycynę. Do konstrukcji biblioteki w wektorze binarnym wykorzystywane są pojedyncze kopie każdego z genów zgromadzonych w bibliotekach cDNA skonstruowanych w wektorach Lambda ZAP i Lambda FLC-1-B. Zalety systemu FOX-hunting, to: i/ mały procent kosupresji genów wskutek stosowania pełnej długości klonów cDNA i znormalizowanych bibliotek w wektorach binarnych; ii/ liczebne ograniczenie ekspresji genów metabolizmu podstawowego (ang. house-keeping genes) w znormalizowanych bibliotekach; iii/ ułatwienia w analizie fenotypowej wynikające z krótkiego cyklu życiowego A. thaliana; iv/ dość łatwa izolacja i sekwencjonowanie genów. Wadą tego systemu jest ograniczenie analizy funkcjonalnej jedynie do genów wykorzystanych do konstrukcji biblioteki w A. tumefaciens. Obydwie techniki, TILLING i FOX-hunting, pozwalają na przyspieszenie analizy genów. Programy je wykorzystujące mogą być również dodatkowym źródłem zróżnicowanego materiału dla hodowli. System TILLING z tej racji, iż został opracowany do badania mutantów indukowanych chemicznie, pozwala na natychmiastowe i bezpośrednie wprowadzanie uzyskanych materiałów do hodowli. System FOX-hunting otwiera głównie perspektywy w analizie funkcjonalnej, generując cenne mutanty, w których obserwuje się nadekspresję genów.

Author of the article: 
Download the article: 

Redakcja
Andrzej ŁUKASZYK – przewodniczący, Szczepan BILIŃSKI,
Mieczysław CHORĄŻY, Włodzimierz KOROHODA,
Leszek KUŹNICKI, Lech WOJTCZAK

Adres redakcji:
Katedra i Zakład Histologii i Embriologii Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu, ul. Święcickiego 6, 60-781 Poznań, tel. +48 61 8546453, fax. +48 61 8546440, email: mnowicki@ump.edu.pl

PBK Postępby biologi komórki